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Licht bis in die hintersten Winkel: Mikroskope mit sich selbst rekonstruierenden Laserstrahlen

Höherer Bildkontrast, höhere Auflösung: Ein Freiburger Forscherteam um Prof. Dr. Alexander Rohrbach ist es gelungen, Laserstrahlen so umzuformen, dass sie bessere Mikroskopaufnahmen ermöglichen.


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Weniger Streuung: Alexander Rohrbachs sich selbst rekonstruierende Laserstrahlen bleiben im Zentrum länger stabil, wenn sie ein Objekt durchdringen. Foto: Universität Freiburg

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Autofahren im Nebel oder Mikroskopieren dicker Objekte – in beiden Situationen trifft man auf das gleiche Problem: Das Licht wird gestreut. Beim Autofahren sorgen Nebeltröpfchen dafür, dass das Scheinwerferlicht Hindernisse nicht erreicht und somit auch nicht vollständig beleuchtet. Bei Lichtmikroskopen, wie sie zum Beispiel in der modernen Zellbiologie verwendet werden, streuen ähnlich den Nebeltröpfchen dichte Ansammlungen Tausender Zellen das Beleuchtungslicht des Mikroskops. Und das so stark, dass weiter von der Lichtquelle entfernte Zellen des zu untersuchenden Objekts kaum noch zu sehen sind.


Alexander Rohrbach, Professor für Bio- und Nano-Photonik, ist es gelungen, die ungewollte Ablenkung und Streuung des Beleuchtungslichts im Inneren des Objekts deutlich zu reduzieren. Zusammen mit seiner Arbeitsgruppe entwickelt er am Institut für Mikrosystemtechnik der Universität Freiburg ein neuartiges Mikroskopieverfahren, das auf sich selbst rekonstruierenden Laserstrahlen basiert.

 

  • Streuung des Lichts reduzieren

Für Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler, die vergleichsweise große Proben von bis zu fast einem Millimeter Dicke untersuchen, ist diese Entwicklung von Vorteil. Bisher stieß die Mikroskopie bei der Beleuchtung beispielsweise von Krebszellclustern, isolierter Haut oder Tierembryos, die aufgrund ihrer Größe das Licht stark streuen, oft an ihre Grenzen. Denn der verwendete Laserstrahl verliert durch Streuung an vielen kleinen Partikeln seine ursprüngliche gebündelte Form oder wird abgelenkt. Dadurch ist unter dem Mikroskop im hinteren Teil des Objekts kaum etwas zu erkennen. Rohrbach, von Haus aus Physiker, hat sich schon vor vielen Jahren auch biologischen Systemen zugewandt, bei denen es bisher jedoch nur bedingt gelungen ist, alle Informationen herauszuziehen. Beispielsweise ist noch nicht klar, wann und wie welche Kräfte im Zellinneren aufgebaut werden. „Dafür werden neue Mikroskopiertechniken, Denkansätze und Analysen benötigt“, erklärt Rohrbach – und das entfacht seinen Forscherdrang immer wieder aufs Neue.

 

  • Idee der Lichtscheibenmikroskopie als Grundlage
Wie einige andere Arbeitsgruppen zuvor griff der Freiburger Professor für seine Entwicklung die mehr als 100 Jahre alte Idee der Ultramikroskopie wieder auf. In der Ultramikroskopie oder Lichtscheibenmikroskopie, wie sie heute heißt, werden die Objekte nur in einer bestimmten Ebene, der Fokusebene des Mikroskopobjektivs, beleuchtet. Dies gelingt mit einer Lichtscheibe, die von der Seite in das Objekt eingestrahlt wird. Alle Objektteile außerhalb dieser Ebene bleiben unbeleuchtet und somit dunkel. Um die Lichtscheibe zu erzeugen, kann man eine spezielle Zylinderlinsenanordnung verwenden. Oder in der Fokusebene einen Laserstrahl schnell hin und her bewegen, um eine noch dünnere Scheibe zu erhalten. Jedoch wird das seitlich eingestrahlte Licht an vielen Zellen und Grenzflächen, also Übergängen zwischen verschiedenen Materialien, gestreut und abgelenkt. An diesem Punkt setzt Rohrbach mit seiner Idee an: Er kann die Streuung durch den Einsatz neuer, sich selbst rekonstruierender Strahlen reduzieren.
 
  • Bessel-Strahlen dringen tiefer ein
In mehreren Experimenten zeigten Rohrbach und sein Team, dass speziell geformte Laserstrahlen auch dann näherungsweise ihr ursprüngliches Profil rekonstruieren können, wenn verschiedene Hindernisse, beispielsweise viele lichtstreuende biologische Zellen, das Profil des Strahls immer wieder zerstören. Diese Selbstrekonstruktion funktioniert, weil gestreute Photonen, also Lichtquanten, im Zentrum des Strahls kontinuierlich durch neue, von der Seite kommende ersetzt werden. „Es ist ein erstaunliches Phänomen, dass die von der Seite kommenden Photonen trotz massiver Verzögerungen durch die streuenden Zellen alle fast gleichzeitig im Zentrum eintreffen, um dort ein neues Strahlprofil zu bilden.“

 

  • Laserstrahlen werden mit computergesteuerten Hologramm umgeformt
Um diese speziellen Laserstrahlen zu erzeugen, formten die Freiburger Forscher gewöhnliche Laserstrahlen zu so genannten Bessel-Strahlen um. Das ist am flexibelsten möglich mit einem computergesteuerten Hologramm, das die Flugrichtung der Photonen ortsabhängig über den Strahlquerschnitt verändert. Es war bekannt, dass das Profil von Bessel-Strahlen im streuungsfreien Raum weitgehend stabil bleibt. Aber bis vor Kurzem war völlig unklar, ob und inwieweit sie auch in inhomogener Materie, also dort, wo viel Streuung stattfindet, ihre ursprüngliche Strahlform von alleine zurückgewinnen können.
Das konnte Rohrbach zunächst theoretisch mit Computersimulationen vorhersagen und wenig später mit Versuchen verifizieren. Damit konnte er zeigen, dass sich spezielle holografisch geformte, sich selbst rekonstruierende Laserstrahlen für die Mikroskopie besonders gut eignen, da sie robuster gegen die störende Streuung sind. Die Bessel-Strahlen können tiefer in zu untersuchende Objekte wie Hautstücke oder Krebszellhaufen eindringen.

Doch auch Bessel-Strahlen funktionieren bei diesen Anwendungen nicht völlig problemlos. Denn nur circa 20 Prozent der Lichtteilchen befinden sich im zentralen Hauptstrahl, die übrigen werden in einem Ringsystem um das Zentrum herum transportiert. Dieses ausgedehnte Ringsystem, das den Hauptstrahl umgibt, verhilft zwar dem Strahl zur Selbstrekonstruktion, führt aber beim Mikroskopieren auch zu einem schlechten Bildkontrast.

 

  • Höherer Bildkontrast, höhere Auflösung 
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Schärferer Blick: Mit den neuen Mikroskopen lassen sich einzelne Bereiche von Krebszellhaufen detailreicher darstellen. Foto: Universität Freiburg

Rohrbach ist es jedoch gelungen, auch dieses Problem zu lösen: Er entwickelte eine Methode, die die Stabilität des Strahls bei der Durchdringung des Objekts ausnutzt. Dabei wird das Objekt nicht auf einmal, sondern Linie für Linie beleuchtet – vergleichbar mit der Bewegung eines linienförmigen Scheibenwischers, der über die gesamte Fläche der Scheibe wandert. Gleichzeitig nimmt eine Kamera das Objekt ebenfalls linienweise, wie durch eine Schlitzblende, auf. Damit wird das Licht des Ringsystems ausgeblendet. Im Vergleich zur herkömmlichen Lichtscheibenmikroskopie mit konventionellen Laserstrahlen wird dadurch der Bildkontrast um 50 Prozent gesteigert und die axiale Auflösung – also der kleinste trennbare Abstand hintereinanderliegender Bildpunkte – des dreidimensionalen Bildes um nahezu 100 Prozent verbessert.

  • Neue Einblicke und Analysen für Biologen und Mediziner
Die von Rohrbachs Gruppe entwickelten Lichtmikroskope liefern nicht nur neue Einblicke in die physikalisch komplexen Vorgänge der Lichtstreuung, sondern ermöglichen Forscherinnen und Forschern der Biologie oder Medizin auch neue Einblicke und Analysen. So können sie etwa anderthalbmal so tief in menschliche Hautproben hineinschauen wie mit konventionellen Laserstrahlen. Die neue Methode ermöglicht darüber hinaus, zum Beispiel Vorgänge wie Zellbewegungen innerhalb verschiedener Hautschichten, die auf Kontaktallergien oder einen Sonnenbrand folgen, vierdimensional, also mit sich zeitlich ändernden 3-D-Bildaufnahmen, sichtbar zu machen. „Die neue Methode ist keine Wunderwaffe, aber in der Lichtscheibenmikroskopie ist sie das Beste, was zurzeit physikalisch machbar ist.“
Rohrbach plant, zusammen mit Kolleginnen und Kollegen aus dem Freiburger Forschungscluster BIOSS, dem Centre for Biological Signalling Studies, mit seinen Mikroskopen unter anderem die Dynamik von Krebszellhaufen zu untersuchen. Dafür werden er und sein junges Team weiterhin daran arbeiten, die Bildqualität von Mikroskopen mit sich selbst rekonstruierenden Laserstrahlen und Computerhologrammen zu verbessern: „Die Zukunft der modernen Mikroskopie liegt in einer mittels Laser und Computer optimierten Wechselwirkung zwischen Licht und Zelle – und das für jede einzelne Strahlposition.“
 
Die Druckversion dieses Textes (pdf) finden Sie hier.
 

 

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Prof. Dr. Alexander Rohrbach

Alexander Rohrbach ist seit Januar 2006 Professor für Bio- and Nano-Photonik am Institut für Mikrosystemtechnik der Universität Freiburg sowie seit November 2007 Mitglied der Fakultät für Physik und des Exzellenzclusters BIOSS (Centre for Biological Signalling Studies) der Universität Freiburg. Nach seinem Studium der Physik an der Universität Erlangen-Nürnberg, das er 1994 abschloss, wurde Rohrbach 1998 in Heidelberg promoviert. Während seiner Dissertationszeit forschte er zu Lichtmikroskopie und Zellbiologie am Kirchhoff-Institut für Physik und am Max-Planck-Institut für medizinische Forschung in Heidelberg. Nach verschiedenen Studien über optische Kräfte und zellbiologische Anwendungen schloss er 2005 seine Physik-Habilitation an der Universität Heidelberg ab. Seine Forschungsschwerpunkte sind optische Fallen mit interferometrischer Partikelverfolgung, molekulare Motoren, Zytoskelett-Mechanik und neuartige Laser-Mikroskopiemethoden. (Foto: Manfred Zahn)

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Florian Fahrbach

ist seit Mai 2008 Doktorand bei Prof. Dr. Alexander Rohrbach im Fachbereich Bio- and Nano-Photonik am Institut für Mikrosystemtechnik der Universität Freiburg. Zuvor studierte er ab 2001 Physik in Freiburg und am Imperial College in London.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Wie gelangt das Licht im Mikroskop bis in den hintersten Winkel eines Objekts? Und was reizt einen Forscher, daran zu arbeiten? Ein Gespräch mit Florian Fahrbach, Doktorand am Lehrstuhl für Bio- und Nano-Photonik von Prof. Dr. Alexander Rohrbach. Mit ihm zusammen entdeckte Fahrbach, wie Mikroskopaufnahmen mit sich selbst-rekonstruierende Laserstrahlen verbessert werden können.

Surprising Science: Wie sind Sie für Ihre Doktorarbeit auf dieses Thema gekommen: Hatten Sie im Vorfeld Erfahrung mit dem Mikroskopieren und dem dabei auftretenden Problem der Lichtstreuung?

Florian Fahrbach: Die Erforschung der Lichtscheibenmikroskopie mit holographisch geformten selbst-rekonstruierenden Strahlen war schon das Thema meiner Physik-Diplomarbeit. Darauf kam ich eher durch Zufall: Während meines Studiums hatte ich mich eher für Atomphysik interessiert. Dort spielt die Optik allerdings auch eine entscheidende Rolle als Werkzeug. Ein Vortrag von Prof Rohrbach über die Nutzung optischer Fallen zur Untersuchung bio-physikalischer Fragestellungen hat mich für das Thema begeistert. Ich hatte zu dem Zeitpunkt keinerlei Erfahrung im Bereich der Mikroskopie – nur die eher abschreckende Erinnerung an einen Versuch im physikalischen Anfängerpraktikum. Während der Diplomarbeit konnte ich mich zwar nur einarbeiten, ein funktionierendes Mikroskop bauen und erste Messungen durchführen, aber mein Interesse an der Entwicklung moderner mikroskopischer Techniken war endgültig geweckt: Ich wollte auf diesem Gebiet weiterarbeiten und die selbstrekonstruierenden Strahlen genauer untersuchen.

Surprising Science: Welche Probleme hatten Forschende bisher beim Mikroskopieren, wenn sie relativ große Objekte wie Krebszellhaufen untersuchen mussten?

Florian Fahrbach: Die lichtmikroskopische Untersuchung von großen, stark streuenden Objekten ist eine besondere Herausforderung - auch weiterhin. Die Beleuchtung mit holographisch geformten sich selbst-rekonstruierenden Strahlen stellt aber einen interessanten Lösungsansatz dar, der es ermöglicht, mehr Information aus streuenden Objekten zu ziehen. Ein gutes Bild mit hohem Informationsgehalt ist kontrastreich – das bedeutet, dass ein hohes Signal bei geringem Hintergrund mit hoher räumlicher Auflösung gemessen wird. Außerdem soll das Mikroskop eine getreue 3D-Abbildung des Objektes im PC, also frei von Artefakten, liefern. Optimalerweise werden bei der Mikroskopie sehr gezielt bestimmte Bereiche beleuchtet, die von Interesse sind. Wenn das Licht aber durch das Objekt gestreut wird, ist diese präzise Beleuchtung unmöglich, da die Photonen im Objekt nicht die vorgegebene Richtung einhalten. Daher werden auch andere Teile des Objektes beleuchtet und der Kontrast des Bildes sinkt bis nur noch falsche oder keine Rückschlüsse mehr auf die Struktur des Objektes möglich sind. 

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Besserer Kontrast, höhere Auflösung: Der zentrale Hauptstrahl des Lasers beleuchtet das Objekt Linie für Linie. Gleichzeitig nimmt eine Kamera das Objekt wie durch eine Schlitzblende auf. Damit wird das vom Ringsystem kommende Licht ausgeblendet.(Graph mit Laser)

Surprising Science: Wie liefen die Experimente ab, bei denen gezeigt werden konnte, dass speziell geformte Laserstrahlen auch dann näherungsweise ihr ursprüngliches Profil rekonstruieren können, wenn verschiedene Hindernisse, das Profil des Strahls immer wieder zerstören?


Florian Fahrbach: Es wurden eine ganze Reihe von Experimenten durchgeführt und viele Parameter untersucht, wie zum Beispiel die Stärke der Streuung oder die Zusammensetzung des streuenden Objektes. Neben der Untersuchung von biologischen Objekten wurden auch künstliche Proben aus fluoreszenten Mikropartikeln erstellt. Diese haben einige Vorteile: Sie ermöglichen es, die Streueigenschaften von biologischem Material sehr fein nachzubilden. Aufgrund ihrer bekannten Abmessungen erlauben sie auch, die optische Leistung des Mikroskops zu messen sowie den Vergleich zwischen Simulation und Messung. Am anschaulichsten kann die Selbstrekonstruktion mit Simulationsdaten visualisiert werden, weil man hier Zugriff auf den Strahlquerschnitt an allen Positionen entlang der Ausbreitung durch das Medium hat. Anhand eines Vergleichs mit dem Profil des ungestreuten Strahls wird die Selbstrekonstruktion des Strahls erkennnbar. Bei Messungen hat man notwendigerweise keinen direkten Zugriff auf das Strahlprofil im Inneren des Objektes, kann aber mit einem Lichtscheibenmikroskop ein Bild von der Seite aufnehmen. Wir haben auf diese Weise zum Beispiel die Selbstähnlichkeit des Bildes des Strahls für verschiedene Positionen in der Probe, an denen der Strahl unterschiedlich gestreut wird, ausgewertet. Dabei stellten wir fest, dass die Abhängigkeit des Strahlprofils von der Streuung bei selbstrekonstruierenden Strahlen deutlich geringer ist – ein klares Zeichen für die Selbstrekonstrukionseigenschaften des Strahls in streuenden Medien.

Surprising Science: Wie kann man mit computergesteuerten Hologrammen Strahlen formen?

Florian Fahrbach: Anders als ein normales Bild, dass nur Lichtintensitäten wiedergibt, also die Zahl der Photonen, enthält ein Hologramm – dessen Name in etwa mit „vollständiges Bild“ erklärt werden kann - sowohl Informationen über die Anzahl als auch über die Richtung der Photonen. Mit einem computergesteuerten Hologramm kann man also mit hoher Auflösung sowohl die Anzahl als auch die Richtung von Photonen beeinflussen. Um die Änderung der Flugrichtung eines Photons durch ein computergesteuertes Hologramm zu verstehen, hilft es, wenn man sich das Gerät als einen Spiegel vorstellt, den man mit extrem hoher Präzision verformen kann. Man kann über den Computer nun zum Bespiel ein Hologramm geben, das so wirkt wie eine gewöhnliche Linse, kann dabei aber die Brennweite sehr präzise einstellen. Außerdem kann ein kegelförmiges optisches Element, das Axikon, holographisch darstellen und so Bessel-Strahlen fast beliebiger Größe und Form erzeugt werden. Mit geeigneter Software benötigt es dazu nicht mehr als einen Knopfdruck am PC.

Surprising Science: Welchen Einfluss hat die Dicke des Laserstrahls auf die Bildqualität?

Florian Fahrbach: In der Lichtscheibenmikroskopie bestimmt die Dicke des Laserstrahls die Dicke des Bereichs innerhalb des Objektes, das beleuchtet wird. Das Detektionsobjektiv bildet das gesamte beleuchtete Volumen ab. Allerdings wird nur ein schmaler Bereich um die Fokusebene des Objektivs auch scharf abgebildet. Das Objektiv kann nicht zwischen Vorder- und Hintergrund selektieren und man erhält darum die Überlagerung der Abbildung des scharfen Bildes aus der Fokusebene und der unscharfen Bilder der darum liegenden Ebenen. Für den Betrachter des Bildes wird es dann mit wachsender Dicke des Laserstrahls immer schwieriger, relavante Information aus dem Bild zu ziehen.


Surprising Science: Was sind Ihre nächsten Forschungsschritte: Werden Sie – in oder nach Ihrer Doktorarbeit – weitere Fragestellung bezüglich des Bessel-Strahls und dessen Ringsystem lösen - beziehungsweise lösen müssen? Ist eine Verbesserung Ihrer Methode überhaupt möglich?

Florian Fahrbach: Meine Doktorarbeit habe ich mittlerweile so gut wie abgeschlossen. Die konfokale Lichtscheibenmikroskopie mit Bessel-Strahlen ist optisch gesehen zurzeit das Optimum und liefert die beste Bildqualität. Aber es gibt sicherlich noch immer Raum für Verbesserungen, insbesondere um noch anspruchsvollere Objekte abbilden zu können. Außerdem liegt mir die weitere praktische Erprobung der Methode am Herzen. Es wäre schön, viele Biologen und andere potentielle Anwender davon überzeugen zu können, auch so ein Mikroskop zu bauen und für spezifisch biologische Fragestellungen zu verwenden – dann wenn ein gewöhnliches Mikroskop eben nicht mehr ausreicht.

 
Die Druckversion dieses Textes (pdf) finden Sie hier.

 

 

Bildergalerie

 

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Der Freiburger Professor griff für seine Entwicklung die alte Idee der Ultramikroskopie wieder auf. In der Ultramikroskopie oder Lichtscheibenmikroskopie, wie sie heute heißt, werden die Objekte nur in einer bestimmten Ebene, der Fokusebene des Mikroskopobjektivs, beleuchtet. Dies gelingt mit einer Lichtscheibe, die von der Seite in das Objekt eingestrahlt wird. Der Gauß'sche Strahl: Bei Lichtmikroskopen streuen tausende Zellen das Beleuchtungslicht des Mikroskops. Durch die Streuung an den vielen kleinen Partikeln verliert der verwendete Laserstrahl seine ursprüngliche gebündelte Form oder wird abgelenkt. Dadurch ist unter dem Mikroskop im hinteren Teil des Objekts kaum etwas zu erkennen. Der Bessel-Strahl: Rohrbach und sein Team konnten zeigen, dass speziell geformte Laserstrahlen auch dann näherungsweise ihr ursprüngliches Profil rekonstruieren können, wenn verschiedene Hindernisse, beispielsweise viele lichtstreuende biologische Zellen, das Profil des Strahls immer wieder zerstören. Dafür formten sie gewöhnliche Laserstrahlen zu so genannten Bessel-Strahlen um.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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